Współczesne podejście do zapobiegania i leczenia kandydozy jamy ustnej – wykorzystanie preparatów firmy Curasept

Materiały i metoda

Organizmy i warunki wzrostu

W badaniach wykorzystano cztery szczepy wzorcowe grzybów z rodzaju Candida, reprezentujące te, które najczęściej powodują drożdżycę błony śluzowej jamy ustnej. Szczepy pochodziły z kolekcji ATCC (ang. American Type Culture Collection): Candida albicans ATCC 10231, Candida parapsilosis ATCC 22019, Candida tropicalis ATCC 66029 i Candida kefyr ATCC 2512 i należą do banku szczepów Katedry i Zakładu Mikrobiologii i Wirusologii Wydziału Nauk Farmaceutycznych w Sosnowcu. Przechowywane były w temperaturze -80°C, w bulionie tryptozowo-sojowym z dodatkiem glicerolu. W celu namnożenia i sprawdzenia czystości poszczególne szczepy przesiano na szalkę Petriego z agarem wzbogaconym 5-proc. odwłóknioną krwią baranią oraz podłożem Sabourauda z chloramfenikolem. Po 24-godzinnej inkubacji w cieplarce laboratoryjnej, w 37°C, w warunkach tlenowych, z podłoża Sabourauda z chloramfenikolem pobrano próbki wyrosłych kolonii i wykonano, dodając jałowy roztwór soli fizjologicznej, zawiesinę o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Gęstość oceniano spektrofotometrycznie. Następnie 1 ml tak przygotowanej zawiesiny (dla każdego szczepu) sterylną pipetą naniesiono na powierzchnię stałego podłoża Sabourauda z chloramfenikolem i równomiernie rozprowadzono po całej jej powierzchni. Przygotowano 8 sztuk takich szalek, po 2 dla każdego badanego szczepu. Szalkę Petriego, na jej szklanej części, podzielono flamastrem na 4 równe fragmenty. Tak przygotowane płytki umieszczono w cieplarce.

Oceniane substancje

W celu sprawdzenia działania przeciwgrzybiczego w badaniu wykorzystano trzy substancje o konsystencji żelu do zastosowania klinicznego w stomatologii firmy Curasept (Saronno, Włochy). Żel PREVENT – zawierający w swoim składzie ozonowaną oliwę z oliwek, olejek z drzewa herbacianego, colostrum i stevię; żel PERIODONTAL GEL ADS 100 – zawierający dwuglukonian chlorheksydyny w stężeniu 1% oraz żel PERIODONTAL GEL ADS 350 − zawierający dwuglukonian chlorheksydyny w stężeniu 0,5%.

Grupy badane i kontrolne

Do badania przygotowano także 96 sterylnych krążków bibuły o średnicy 5 mm. Podzielono je po 24 dla każdego szczepu, po 12 na każdą z szalek, po 3 na każde z 4 wyróżnionych pól.

Sprawdź inne artykuły z kategorii PERIODONTOLOGIA.

Po 6 h inkubacji w cieplarce wyjęto wszystkie szalki Petriego z niewidocznymi jeszcze wyrosłymi koloniami drożdży, a następnie na każdej z nich wyodrębniono trzy grupy badane i grupę kontrolną (fot. 1).

Grupy badane:

• G1 – trzy krążki bibuły nasączano żelem PREVENT przez 1 min aż do uzyskania jednorodnej na całej powierzchni zmiany koloru krążka. Następnie usunięto nadmiar żelu oraz umieszczono je w lewej, górnej ćwiartce szalki,
• G2 – trzy krążki bibuły nasączano 1-proc. żelem Periodontal Gel ADS 100 i umieszczono w lewej, dolnej ćwiartce,
• G3 – trzy krążki bibuły nasączano 0,5-proc. żelem Periodontal Gel ADS 350 i umieszczono w dolnej, prawej ćwiartce,
• G4 – grupa kontrolna – trzy krążki bibuły nasączone roztworem soli fizjologicznej (NaCl 0,9% B.Braun, Melsungen, Niemcy) umieszczono w górnej, prawej ćwiartce płytki Petriego.

Na środku każdej płytki umieszczono także jałowy 1-centymetrowy fragment miarki w celu możliwości oceny wielkości przyszłej średnicy strefy zahamowania wzrostu drożdży na podstawie dokumentacji fotograficznej wykonanej do badania. Bezpośrednio po nałożeniu krążków wszystkie przygotowane płytki Petriego umieszczono w cieplarce laboratoryjnej MIR-262 SANYO (Etten-Leur, Holandia) i inkubowano w standardowych warunkach tlenowych. Po upływie 24, 48, 72, 96, 120 h inkubacji płytki wyjmowano z cieplarki i fotografowano aparatem DMC-G80 Lumix Panasonic (Osaka, Japonia) z obiektywem Lumix Panasonic H-FS 2060 12-60 micro-HD (Osaka, Japonia), z odległości 30 cm. Aparat zamontowano na statywie.

Po zgromadzeniu wszystkich zaplanowanych zdjęć dokonano ich analizy w programie ImageJ (LOCI, University of Wisconsin). Dokonano pomiaru największej i najmniejszej wielkości strefy zahamowania wzrostu drożdży (w przypadku stwierdzenia niejednorodnego hamowania) wokół każdego krążka na płytce. Pomiar prowadzono od brzegu krążka bibuły do końca jednorodnej strefy zahamowania wzrostu drożdży. Uzyskane w ten sposób wyniki poddano ocenie statystycznej.

Wyniki badań

We wszystkich badanych szczepach i zaplanowanych czasach zaobserwowano stopniowy, jednorodny, zlewny (niepoliczalny) wzrost jednostek formujących kolonie (CFU – ang. colony forming units) na powierzchni szalek Petriego (fot. 2). Szczególnie dobrze widoczny i niezaburzony niczym wzrost zaobserwowano w ćwiartkach górnych, prawych (G4) – stanowiących kontrolę badania (fot. 3).

Przez 120 h prowadzonej obserwacji wokół żadnego krążka bibuły nasączonego solą fizjologiczną, w żadnym badanym szczepie Candida nie odnotowano najmniejszej strefy zahamowania wzrostu kolonii. Zupełnie odmienny obraz obserwowano=wokół krążków bibuły nasączonych odpowiednio 1-proc. i 0,5-proc. roztworami dwuglukonianu chlorheksydyny oraz ozonowaną oliwą z oliwek wraz z olejkiem z drzewa herbacianego. We wszystkich badanych szczepach i zaplanowanych czasach zaobserwowano strefy zahamowania wzrostu kolonii. Strefy te miały jednak różny charakter. Maksymalne uzyskane wyniki z sześciu pomiarów dla każdego szczepu przedstawiono na fot. 4. Największa strefa zahamowania została odnotowana dla preparatu zawierającego 1-proc. dwuglukonian chlorheksydyny. Jego działanie było najefektywniejsze dla szczepu Candida parapsilosis ATCC 22019, gdzie największa wielkość (mierzona od brzegu bibuły do brzegu strefy zahamowania wzrostu) wynosiła 7,05 mm. Kolejne miejsca zajmowały Candida kefyr, Candida albicans, a najmniejsze pole zahamowania występowało w szczepie Candida tropicalis. W przypadku drugiego preparatu z zawartością chlorheksydyny 0,5% najefektywniejsze działanie również zostało wykazane dla Candida parapsilosis, a kolejność malejąca stref zahamowania była taka sama. W przypadku preparatu zawierającego ozonowaną oliwę z oliwek oraz olejek z drzewa herbacianego – największą efektywność działania uzyskano wobec szczepu Candida albicans ATCC 10231. Strefy zahamowania były wyraźnie mniejsze niż dla preparatów z chlorheksydyną niezależnie od badanego szczepu drożdży.

Podsumowanie

Kandydoza jamy ustnej należy do jednych z najczęstszych schorzeń błony śluzowej jamy ustnej i stanowi wyzwanie kliniczne. Ze względu na częstą oporność drożdży na konwencjonalne antymikotyki, poszukiwania nowych, skutecznych, jak i dostępnych dla pacjenta metod leczenia jest wyzwaniem dla środowiska naukowego i lekarza klinicysty. Analiza wyników badań własnych oraz innych autorów pozwala na uznanie, iż chlorheksydyna w ocenianych stężeniach może być skutecznym uzupełnieniem konwencjonalnej terapii przeciwgrzybicznej. Ponadto stosowanie jej w formie żelu ułatwia aplikację i zapewnia dobrą adhezję na płytę protezy czy błonę śluzową jamy ustnej. Warto jednak pamiętać, aby nie stosować jej miejscowo, równocześnie z nystatyną, ponieważ wchodzą w interakcję lekową, oraz że terapia powinna trwać kilka tygodni. Zastosowanie żelu z ozonowaną oliwą z oliwek, a w szczególności w połączeniu z olejkiem z drzewa herbacianego, ze względu na swoje udowodnione działanie również pozwala na zastosowanie w alternatywnym leczeniu grzybicy (9, 13). Uzyskane wyniki badanego preparatu Prevent (nazwa pochodzi od prewencji – zapobiegania) potwierdzają słuszność jednego ze wskazań producenta do jego stosowania, w sytuacji przez parę tygodni, 3-4 razy dziennie, po zakończonej sukcesem terapii przeciwgrzybiczej, który trzyma pod kontrolą niewielką liczbę kolonii Candida jako szczepu saprofitycznego, bez eradykacji innych eubiotycznych mikroorganizmów, w celu zachowania prawidłowej biocenozy jamy ustnej.

Wybrane do badań preparaty wykazały dużą skuteczność i powinny być rozważone przez lekarza dentystę jako środek mający na celu zapobiegnięcie rozwojowi zakażenia grzybiczego i wspomożenie jego leczenia, gdy już ono wystąpi. Ponadto preparaty te ze względu na konsystencję, dobry smak i łatwość w aplikacji sprzyjają wygodzie i systematycznemu stosowaniu przez pacjentów, co również pozytywnie wpływa na uzyskiwane wyniki leczenia.

dr hab. n. med. Rafał Wiench, dr n. med. Anna Kuśka-Kiełbratowska – Zakład Chorób Przyzębia i Błony Śluzowej Jamy Ustnej, Katedry Stomatologii Zachowawczej z Endodoncją, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
lek. dent. Maksymilian Kiełbratowski – Katedra Stomatologii Zachowawczej z Endodoncją, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
dr n. biol. Małgorzata Kępa – Katedra Mikrobiologii i Wirusologii, Wydziału Nauk Farmaceutycznych w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Piśmiennictwo

1. Naglik J.R., Challacombe S.J, Hube B.: Candida albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis. „Microbiol. Mol. Biol. Rev.”, 2003, 67, 3, 400-428.
2. Akpan A., Morgan R.: Oral candidiasis. „Postgrad. Med. J.”, 2002, 78, 922, 455-459.
3. Scully C., El- Kabir M.: Candida and Oral Candidosis: A Review. „Crit. Rev. Oral Biol. Med.”, 1994, 5, 2, 125-157.
4. Marchlik W.D., Kurnatowski P.: Grzyby jako czynniki etiologiczne zakażeń szpitalnych Fungi as pathogens in nosocomial infections. „Otorynolaryngologia”, 2010, 9, 2, 50-54.
5. Szałtys D.: Prognoza ludności na lata 2014-2050. 2014.
6. Paczkowska I., Wójtowicz A., Malm A.: Wybrane aspekty farmakoterapii kandydoz. „Ter. i leki”, 2010, 66, 8, 539-543.
7. Kubicka-Musiał M., Musiał S., Wierucka-Młynarczyk B. i wsp.: Częstość występowania infekcji grzybiczej oraz ocena lekowrażliwości grzybów z rodzaju Candida u pacjentów z objawami pieczenia błony śluzowej jamy ustnej. „Dent. Med. Probl.”, 2011, 48, 3, 364-370.
8. Soares I.H. i wsp.: In vitro activity of essential oils extracted from condiments against fluconazole-resistant and- sensitive Candida glabrata. „J. Mycol. Med.”, 2015, 25, 3, 213-217.
9. Dalwai S. i wsp.: Comparative evaluation of antifungal action of tea tree oil, chlorhexidine gluconate and fluconazole on heat polymerized acrylic denture base resin – an in vitro study. „Gerodontology”, 2016, 33, 3, 402-409.
10. Malik A., Tyagi A.K.: Liquid and vapour-phase antifungal activities of selected essential oils against candida albicans: Microscopic observations and chemical characterization of cymbopogon citratus. „BMC Complement. Altern. Med.”, 2010, 10, 65, 1-11.
11. Kuśka-Kiełbratowska A. i wsp.: Evaluation of the Sensitivity of Selected Candida Strains to Ozonated Water − An In Vitro Study. „Medicina (Kaunas)”, 2022, 58, 12.
12. Wiench R. i wsp.: Influence of incubation time on orthotoluidine blue mediated antimicrobial photodynamic therapy directed against selected Candida strains − An in vitro study. „Int. J. Mol. Sci.”, 2021, 22, 20.
13. Monzillo V. i wsp.: Ozonized gel against four Candida species: A pilot study and clinical perspectives. „Materials (Basel)”, 2020, 13, 7, 1-7.