Ocena wpływu wybranych substancji pomocniczych na działanie dezynfekcyjne diglukonianu chlorheksydyny

Title: Evaluation of the influence of selected excipients on the disinfection activity of chlorhexidine digluconate
Streszczenie: Diglukonian chlorheksydyny (CHG) jest uważany za najskuteczniejszy i najbezpieczniejszy środek przeciwbakteryjny stosowany w stomatologii, ale dodatki substancji pomocniczych w preparatach złożonych mogą zmieniać ten stan. Dlatego celem badania było porównanie działania bakteriobójczego i grzybobójczego gotowych złożonych płukanek z CHG i ich poszczególnych substancji składowych na wybrane szczepy wzorcowe. Badania wykonano metodą dyfuzyjno-krążkową z wykorzystaniem szczepów wzorcowych bakterii Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa oraz drożdży C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis. Oceniono skuteczność dezynfekcyjną trzech komercyjnych, złożonych płukanek z diglukonianem chlorheksydyny oraz dwóch czystych substancji pomocniczych poprzez porównanie wielkość stref zahamowania wzrostu drobnoustrojów. Otrzymane wyniki pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków: Wszystkie badane złożone płukanki wykazały się dobrym działaniem zarówno grzybobójczym, jak i bakteriobójczym w stosunku do ocenianych mikroorganizmów. Zastosowanie dodatkowych substancji czynnych, niezależnie od ich konfiguracji, nie powodowało zmiany skuteczności ocenianych płukanek złożonych.
Słowa kluczowe: chlorheksydyna, działanie przeciwdrobnoustrojowe, dezynfekcja
Summary: Chlorhexidine digluconate (CHG) is considered the most effective and safe antibacterial agent used in dentistry, but adding excipients in complex preparations can change this state. Therefore, the study aimed to compare the bactericidal and fungicidal effects of complex mouthwashes with CHG and their components on selected reference strains. The analyses were performed using the disk diffusion method using bacterial and yeast reference strains Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, and C. parapsilosis. The disinfection efficacy of three commercial, complex types of mouthwash with chlorhexidine digluconate and two pure excipients was assessed by comparing the size of the inhibition zones of microbial growth. The obtained results enabled the following conclusions to be drawn: All assessed complex rinses showed good fungicidal and bactericidal activity against the evaluated microorganisms. The use of additional active substances, regardless of their configuration, did not change the effectiveness of the evaluated complex mouthwashes.
Keywords: chlorhexidine, antimicrobial activity, disinfection

Chlorheksydyna (CHX) to organiczny związek chemiczny, syntetyczny antyseptyk, pochodna biguanidu. Po raz pierwszy została zsyntetyzowana w 1950 roku w Wielkiej Brytanii (1). Od samego początku znalazła zastosowanie w stomatologii. Może być stosowana w różnych postaciach recepturowych – w formie płynu (np. do płukania jamy ustnej, do irygacji, do odkażania skóry i ran), żelu, lakieru czy tabletek do ssania. Najczęściej CHX spotykana jest w formie soli dioctanu, diglukonianu, dichlorowodorku i fosfonianu, w których związek przyjmuje rolę zasady. Solą najczęściej wykorzystywaną w preparatach do dezynfekcji jest diglukonian chlorheksydyny (CHG) (2).

Cząsteczka CHX zbudowana jest z dwóch symetrycznie umieszczonych pierścieni 4-chlorofenolowych i dwóch guanidynowych grup centralnie połączonych łańcuchem heksametylenowym. Rozpuszczalność CHX w wodzie jest znikoma (0,008% w temperaturze 20°C), jednak jej sole wykazują znacznie większą rozpuszczalność i tak np. możemy otrzymać roztwór diglukonianu chlorheksydyny o stężeniu 20%. Roztwór ten jest formą, w jakiej produkuje się CHG jako półprodukt do przygotowania gotowych płukanek komercyjnych.

Spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego CHG jest szerokie i obejmuje zarówno: wegetatywne formy bakterii Gram-dodatnich, dużą część bakterii Gram-ujemnych, niektóre wirusy DNA i RNA (wirusa opryszki, HIV, wirusa grypy i cytomegalii), jak i drożdże oraz dermatofity. Nie działa natomiast na formy przetrwalnikowe bakterii i niektóre małe wirusy takie jak: HPV, enterowirusy czy wirusy polio (3). W zależności od zastosowanego stężenia CXG oraz warunków otoczenia (pH, temperatura, czas ekspozycji i obecność innych substancji chemicznych), działanie tego mzwiązku może mieć charakter bakteriostatyczny lub bakteriobójczy.

Mechanizm działania CHX wykorzystuje zjawisko oddziaływania cząsteczek o różnych ładunkach powierzchniowych chlorheksydyny i komórki bakterii. Pierwszym etapem jest przyciągnięcie kationowej cząsteczki CHX przez ujemnie naładowaną komórkę bakteryjną. Kolejne etapy polegają na przeniknięciu CHX do wnętrza komórki bakteryjnej i uszkodzeniu jej błony komórkowej, wskutek czego następuje ucieczka niskocząsteczkowych związków z cytoplazmy do otoczenia (głównie jonów K+). Dyfuzja jonów potasu, jak i innych mikroelementów prowadzi do wypływu wody z protoplastu komórki bakteryjnej, co powoduje jej plazmolizę. Ucieczka jonów potasu następuje już przy niewielkich stężeniach chlorheksydyny. Jest to działanie odwracalne, będące etapem bakteriostatycznym. Zwiększenie stężenia CHG prowadzi do wypływu wielkocząsteczkowych związków, np. nukleotydów. Po ucieczce 15% zawartości nukleotydów skutki działania na bakterię stają się nieodwracalne. CHX dezaktywuje również niektóre enzymy błonowe bakterii i prowadzi do precypitacji niektórych elementów cytoplazmy (ATP). Jest to etap bakteriobójczy działania CHG. Skuteczność dezynfekcyjna CHX rośnie wraz ze wzrostem użytego stężenia, mjak i czasu ekspozycji drobnoustroju. Minimalne stężenie hamujące CHX dla Streptococcus mutans wynosi mniej niż 1 μg/ml (3-4).

CHX może wywoływać miejscowe reakcje nadwrażliwości (rzadko uogólnione), fotodermatozy i astmę zawodową. Przy zbyt długim jej stosowaniu (często już po kilku tygodniach) może doprowadzić do przebarwienia powierzchni zębów, języka, wypełnień z materiałów kompozytowych i glasjonomerowych, wystąpienia zaburzeń smakowych i podrażnienia błony śluzowej. Objawy te mają jednak charakter przejściowy i ustępują po zakończonej terapii lub higienizacji (3, 4).

Optymalnym pH dla działania CHX jest zakres od 5,5-7, jednak najwyższy wzrost absorpcji chlorheksydyny przez bakterie obserwuje się w pH 7. Spowodowane jest to wzrostem dostępności ujemnie naładowanych grup obecnych na komórkach bakteryjnych w pH obojętnym.

Alkohol etylowy wzmacnia działanie przeciwbakteryjne CHX, natomiast związki zawierające nieorganiczne aniony wykazują działanie inhibicyjne. Chlorheksydyna reaguje również z podchlorynem sodu, wytrącając się w postaci żółtawego precypitatu (3).

Sprawdź produkty stomatologiczne dostępne w naszym sklepie internetowym dlaspecjalistow.pl.

Jama ustna jest środowiskiem bytowania wielu bakterii i kilku gatunków drożdży. Organizmy te tworzą eubiotyczny mikrobiom, jednak w pewnych warunkach zaburzenia miejscowej, jak i systemowej równowagi organizmu może dojść do dysbiozy. Paciorkowce odpowiadają za zapalenie gardła, migdałków podniebiennych, anginę, a Streptococcus aureus bardzo często jest izolowany z zapaleń kątów oraz skóry szpary ust (5). Candida spp. jest czynnikiem etiologicznym kandydozy, która w dużej mierze dotyka osób starszych z protezami ruchomymi, cukrzyków i osoby z obniżoną odpornością (6). Kontrola zakażeń w obrębie jamy ustnej jest niezmiernie ważnym elementem udanego leczenia stomatologicznego, nie tylko w kontekście stabilności choroby przyzębia i błony śluzowej, ale także w endodoncji, chirurgii, protetyce, a nawet u pacjentów leczonych ortodontycznie z założonymi zamkami wykonanymi z materiałów złożonych i ceramicznych. W tym celu stosuje się zabiegi higienizacyjne w schemacie wizyt raz na trzy miesiące, z zastosowaniem środków odkażających wykazujących szerokie spektrum działania przeciwdrobnoustrojowego, gdzie CHG jest z nich najpowszechniejszy. Zakażenia objawiają się klinicznie obrzękiem, krwawieniem, bólem i uszkodzeniem nabłonka błony śluzowej jamy ustnej oraz trudnościami w spożywaniu pokarmów i utrzymywaniu higieny. W związku z powyższym produkowane są różne preparaty złożone, zawierające CHG oraz dodatkowe substancje czynne o działaniu: przeciwzapalnym, przeciwbólowym, miejscowo znieczulającym, powlekającym, przyspieszającym gojenie się tkanek, uszczelniającym naczynia krwionośne oraz wzmacniającym naturalne mechanizmy odporności. Tak przygotowane komercyjne preparaty przeznaczone są do kompleksowego, jednoczasowego leczenia jamy ustnej, zarówno przyczynowego (eliminacja etiologicznej mieszanej flory drobnoustrojów), jak i objawowego. Niewiele jest jednak badań oceniających wpływ substancji pomocniczych na skuteczność CHG w preparatach złożonych, dlatego celem badania było porównanie działania bakteriobójczego i grzybobójczego gotowych złożonych płukanek z CHG i ich poszczególnych substancji składowych na wybrane szczepy wzorcowe.

Materiał i metoda

Organizmy i warunki wzrostu

Badania wykonano zgodnie z wytycznymi Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), metodą dyfuzyjno-krążkową (wersja 9.0 ze stycznia 2019 r.) (7).

W badaniu wykorzystano cztery szczepy referencyjne bakterii: Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 43300, Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) ATCC 19615, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ATCC 27853, często wykrywane w liszajcu zakaźnym czerwieni wargowej i kątów ust (6), oraz Enterococcus faecalis (E. faecalis) ATCC 29212, wykrywany w zainfekowanym systemie kanałów korzeniowych, oraz cztery szczepy wzorcowe grzybów z rodzaju Candida, reprezentujące te, które najczęściej powodują drożdżycę błony śluzowej jamy ustnej: C. albicans ATCC 10231, C. glabrata ATCC 15126, C. krusei ATCC 14243, C. parapsilosis ATCC 22019 (7). Wszystkie szczepy mikroorganizmów pochodziły z Amerykańskiej Kolekcji Szczepów Wzorcowych (ATCC – ang. American Type Culture Collection) i należą do banku szczepów Katedry i Zakładu Mikrobiologii Wydziału Nauk Farmaceutycznych w Sosnowcu. Przechowywane były w temperaturze -80°C, w bulionie tryptozowo-sojowym z dodatkiem glicerolu.

W celu namnożenia i sprawdzenia czystości poszczególne szczepy przesiano na szalkę Petriego o średnicy 90 mm z agarem wzbogaconym 5-proc. odwłóknioną krwią baranią, o głębokości 4 mm (ok. 25 ml). Powierzchnia agaru była sucha i jednorodna. Po 24-godzinnej inkubacji w 37°C w warunkach tlenowych wykonano w jałowym roztworze soli fizjologicznej inoculum o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co odpowiada około 1,2 x 108 CFU/ml dla bakterii oraz 1-5 x 106 CFU/ml dla grzybów. Gęstość zawiesiny każdorazowo oznaczano za pomocą densytometru Densi La Meter II (Erba Lachema, Brno, Czechy), którego źródłem światła jest LED o długości fali 525 nm. Urządzenie zostało skalibrowane w oparciu o wzorzec 0,5 w skali McFarlanda według zaleceń producenta. Następnie po 15 minutach od przygotowania 1 ml zawiesiny Candida spp. (dla każdego szczepu oddzielnie) sterylną pipetą inokulowano na powierzchnię podłoża Sabourauda z chloramfenikolem (SDA), zaś zawiesiny szczepów S. aureus, E. faecalis i P. aeruginosa na powierzchnię podłoża agarowego Mueller-Hinton (MHA), a zawiesinę szczepu S. pyogenes na powierzchnię podłoża agarowego Mueller-Hinton wzbogaconego 5-proc. odwłóknioną krwią baranią (MHF). Przygotowano 24 sztuki takich szalek, po trzy dla każdego badanego szczepu (n = 3).

Szalki oznaczono cyframi I-VIII, co odpowiadało następującym szczepom:

I. S. aureus ATCC 43300.
II. S. pyogenes ATCC 19615.
III. P. aeruginosa ATCC 27853.
IV. E. faecalis ATCC 29212.
V. C. albicans ATCC 10231.
VI. C. glabrata ATCC 15126.
VII. C. krusei ATCC 14243.
VIII. C. parapsilosis ATCC 22019.

Oceniane substancje oraz grupy badane i kontrolne

Do badania przygotowano 144 sterylne krążki bibułowe (Antimicrobial Susceptibility Test Discs, BLANK DISCS; Oxoid, Basinstoke, Wielka Brytania) o średnicy 6 mm, po 6 sztuk na każdą z szalek. Krążki rozłożono na płytkach zgodnie z wcześniej przygotowanym szablonem. Grupy badane – krążki ułożone na obwodzie szalki – wyekstrahowano, nanosząc po 20 μl płynu na każdy krążek (fot.1a-b) pięcioma badanymi preparatami: trzema komercyjnymi płynami do higieny jamy ustnej firmy Encora (Łaziska Górne, Polska) oraz dwoma preparatami stanowiącymi dodatkowy składnik czynny badanych płukanek.

Nazwy poszczególnych substancji zostały zakodowane w celu zaślepienia próby. Mikrobiolog wykonujący tę część laboratoryjną doświadczenia nie znał klucza kodowania. Probówki z odlanymi z oryginalnych opakowań badanymi substancjami oznaczono następującymi numerami:

1. Płyn Aseptall Concentrate, rozcieńczony (zgodnie z zaleceniami producenta) roztworem soli fizjologicznej (0,9% NaCl) w stosunku 1:1, zawierający m(po rozcieńczeniu) CHG o stężeniu 0,12% oraz mpantenol jako substancję pomocniczą.
2. Gotowy do użycia płyn Aseptall Spray zawierający CHG o stężeniu 0,12 oraz substancje czynne: aloes, pantenol oraz witaminę E.
3. Gotowy roztwór Aloesu (Aloe barbadensis leaf juice) (Alfa Sagittarius, Kraków, Polska).
4. Gotowy roztwór Naturalny Olejek Goździkowy (Eugenia caryophyllus bud oil) (Avicenna-oil, Wrocław, Polska).
5. Gotowy do użycia płyn Aseptall, zawierający CHG o stężeniu 0,12% oraz dodatkowo pantenol, witaminę E oraz olejek goździkowy.
6. Próbę kontrolną stanowił krążek bibułowy (oznaczony literą K) nasączony objętością 20 μl jałowego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl) (B. Braun, Melsungen, Niemcy), umieszczony pośrodku szalki.

Maksymalna liczba krążków na płytce o średnicy 90 mm wynosiła sześć sztuk. Taka liczba krążków zapobiega sytuacji ewentualnego zachodzenia na siebie stref zahamowania wzrostu po inkubacji. Dodatkowo odległości pomiędzy krążkami zgodnie z wytycznymi EUCAST wynosiły ≥ 20 mm, co powodowało, że poszczególne preparaty nie oddziaływały na siebie nawzajem. Wszystkie krążki położono na szalki w ciągu 15 minut od inokulacji. W określonym miejscu każdej szalki umieszczono także jałowy 1-centymetrowy fragment miarki w celu możliwości oceny wielkości przyszłej średnicy strefy zahamowania wzrostu (SZW) drobnoustrojów na podstawie dokumentacji fotograficznej wykonanej do badania. Posiewy inkubowano 24 h w temperaturze 35±2°C w warunkach tlenowych, w cieplarce laboratoryjnej. Po upływie tego czasu płytki wyjmowano, a następnie fotografowano. Aparat Nikon D750 (Tokio, Japonia) z obiektywem AF-S DX Micro Nikkor 85 mm f/3,5G ED VR (Tokio, Japonia) został zamontowany na statywie w odległości 30 cm od powierzchni szalki (fot. 2).

Sprawdź wiecej artykułów z kategorii PERIODONTOLOGIA.

Odczytu średnicy stref zahamowania wzrostu wokół poszczególnych krążków dokonano po zgromadzeniu wszystkich zaplanowanych zdjęć. Analizy dokonano w programie ImageJ (LOCI, University of Wisconsin, USA). Pomiar prowadzono po skalibrowaniu wielkości (dzięki umieszczonej miarce na płytce), od lewej do prawej granicy strefy zahamowania wzrostu mikroorganizmów, równolegle do podstawy zdjęcia tak, aby linia przechodziła przez środek krążka dyfuzyjnego (fot. 3). Uzyskane w ten sposób wyniki (podano w milimetrach) zapisano w programie Excel, a następnie poddano ocenie statystycznej.

Analiza statystyczna

Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Różnice statystyczne między zbiorami danych oceniono za pomocą analizy wariancji (ANOVA) oraz przeprowadzono ocenę post hoc za pomocą testu Newmana-Keulsa. Jako próg wskazujący różnice istotne statystycznie przyjęto wartość p ≤ 0,05. Całość analizy statystycznej przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Statistica mw wersji 7.1 PL (StatSoft, Kraków, Polska).

Wyniki

Uzyskane wyniki badań pokazują wpływ komercyjnych, złożonych preparatów zawierających CHG w stężeniu 0,12% wraz z różnymi dodatkami (krążki 1, 2, 5) oraz czystych dodatków (aloes i olejek goździkowy) (krążki 3, 4) na wzrost wybranych wzorcowych drożdży i bakterii w stosunku do kontroli (krążek 6 – nasączony roztworem soli fizjologicznej). We wszystkich badanych szczepach po 24 h uzyskano zlewny (niepoliczalny) wzrost jednostek tworzących kolonie (CFU – ang. colony-forming units) na powierzchni podłoży w szalkach Petriego (fot. 4).

Szczególnie dobrze widoczny, niezaburzony wzrost kolonii zaobserwowano wokół wszystkich środkowych krążków bibuły (krążek 6) – stanowiących kontrole badania oraz wokół wszystkich krążków nasączonego roztworem aloesu (krążek 3).

Odmienny obraz zaobserwowano wokół krążków bibuły nasączonych roztworami dwuglukonianu chlorheksydyny o stężeniu 0,12% (Aseptall Concentrate – po rozcieńczeniu 1:1 z roztworem soli fizjologicznej, Aseptall Spray, Aseptall Płyn – gotowy do użycia) oraz krążka nasączonego olejkiem goździkowym (krążki 1, 2, 4, 5). We wszystkich badanych szczepach po 24 h zaobserwowano wyraźne strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów, bez pojedynczych kolonii w obrębie stref. Średnice SZW miały jednak różne rozmiary.

Wśród drożdży największą uśrednioną wartość wielkości średnic stref, uzyskaną z trzech pomiarów, odnotowano dla roztworu olejku goździkowego, dla szczepu C. albicans ATCC 10231 i wynosiła ona 29,26 mm (wykres 1).

Kolejno miejsca zajęły: C. glabrata ATCC 15126 – 28,44 mm, C. krusei ATCC 14243 – 28,02 mm oraz C. parapsilosis ATCC 22019 – 25,23 mm. Wyniki te były znamiennie statystycznie różne od tych uzyskanych dla innych badanych substancji. Dla poszczególnych szczepów Candida nie odnotowano natomiast różnic istotnie statystycznie znamiennych pomiędzy badanymi preparatami złożonymi. Najwyższy wynik dla drożdży odnotowano dla szczepu C. krusei ATCC 14243. Wynosił on 8,57 mm dla Aseptall Płyn. Najniższy wynik dla drożdży odnotowano dla szczepu C. glabrata ATCC 15126. Wynosił on 7,22 mm dla Aseptall Spray. Wszystkie wyniki dla badanych gotowych preparatów były istotnie statystycznie różne w porównaniu z kontrolą.

Wśród bakterii największą uśrednioną wartość wielkości średnic stref, uzyskaną z trzech pomiarów, odnotowano dla roztworu Aseptall Concentrate, dla szczepu S. pyogenes ATCC 19615 i wynosił on 16,81 mm (wykres 2).

Kolejno miejsca zajęły: S. pyogenes ATCC 19615 – 15,11 mm dla roztworu Aseptall Spray, S. aureus nATCC 43300 – 15,09 mm dla roztworu Aseptall Spray. Wyniki te były znamiennie statystycznie większe od tych uzyskanych dla grupy kontrolnej. Dla poszczególnych szczepów bakterii nie odnotowano natomiast różnic istotnie statystycznych pomiędzy badanymi preparatami złożonymi. Najniższe wyniki osiągnięto dla szczepu P. aeruginosa – ATCC 27853 – 7,16 mm dla Aseptall Spray, P. aeruginosa ATCC 27853 – 7,82 mm dla Aseptall Płyn i P. aeruginosa ATCC 27853 – 7,97 mm dla Aseptall Concentrate. Te ostatnie wyniki były wyraźnie niższe i istotnie statystycznie różne w porównaniu z innymi badanymi szczepami i z grupą kontrolną (6 mm – szerokość samego krążka dyfuzyjnego).

Omówienie wyników i dyskusja

Celem przeprowadzonego doświadczenia laboratoryjnego było porównanie działania bakteriobójczego i grzybobójczego gotowych złożonych płukanek z CHG i ich poszczególnych substancji składowych na wybrane szczepy wzorcowe. Badanie zostało zaprojektowane tak, aby włączone szczepy wzorcowe mikroorganizmów reprezentowały te powszechnie kojarzone z występowaniem w obrębie jamy ustnej i gardła i/lub związane były z częstymi infekcjami takimi jak kandydoza jamy ustnej, liszajec zakaźny, angina, infekcje endodontyczne, a w leczeniu których powszechnie stosuje się środki odkażające – szczególnie CHG (5, 6). Zaprojektowane zostało ono w takiej formie, aby zbadać wrażliwość sześciu patogenów różniących się od siebie pod względem charakteru cech morfologicznych, jak i fizjologicznych. Trzy mikroorganizmy S. aureus, S. pyogenes oraz E. faecalis są bakteriami Gram-dodatnimi, a jeden – P. aeruginosa – bakterią Gram-ujemną. Różny był również charakter warunków środowiskowych życia wybranych bakterii, a w szczególności różne zapotrzebowanie na składniki odżywcze oraz tlen. Gronkowce (S. aureus), paciorkowce (S. pyogenes) i enterokoki (E. faecalis) są względnymi beztlenowcami, a pałeczka ropy błękitnej (P. aeruginosa) prowadzi ściśle tlenowy metabolizm.

W naszym doświadczeniu CHG jako główny składnik odkażający wszystkich płukanek złożonych wykazał swoje działanie wobec bakterii zarówno Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych oraz drożdży. Działanie CHG na Candida jest słabsze niż na bakterie Gram-dodatnie, jednakże porównywalne jest do wpływu CHG na bakterie Gram-ujemne (P. aeruginosa). Może to wynikać z kilku powodów, takich jak dużo większy rozmiar, drożdże są 25-, a nawet 50-krotnie większe od komórek bakterii, należą do Eucaryota i posiadają dużo bardziej złożoną budowę (8). W komórkach drożdżaków występują wyraźnie uformowane jądro, otoczone błoną jądrową, oraz liczne organella komórkowe. Komórki Candida otoczone są też grubą, trudno przepuszczalną ścianą komórkową składającą się m.in. z beta-glukanu, mannoprotein i chityny.

Mniejszy wpływ CHG na bakterie Gram-ujemne wynika z występowania u tych bakterii grubej ściany komórkowej. Dodatkowo P. aeruginosa wyposażony jest w śluzową, alginianową otoczkę, która zwiększa jego oporność na warunki środowiska i antybiotyki (9).

W badanych produktach warto zwrócić uwagę na dodatkowe substancje, które nie powodowały zmiany skuteczności ocenianych płukanek złożonych, a jednocześnie stanowią istotną rolę w gojeniu się oraz nawilżeniu błony śluzowej jamy ustnej. Zostały zastosowane w preparatach w celu wspomagania leczenia stanów zapalnych jamy ustnej chlorheksydyną, zapewniając dodatkowe działanie objawowe.

Aloes (Aloe barbadensis leaf juice) – jako substancja pomocnicza sama w sobie nie wykazała działania grzybobójczego i bakteriobójczego na szczepy użyte w badaniu, w przeciwieństwie do nierozcieńczonego olejku goździkowego, którego preparat prosty wykazał silne działanie grzybobójcze i nieco słabsze bakteriobójcze. Mechanizm działania dezynfekującego samego olejku goździkowego w przypadku grzybów polega na jego wnikaniu pomiędzy warstwy lipidowe błony komórkowej, co zwiększa jej przepuszczalność, a także uniemożliwia komórkom C. albicans adhezję do komórek gospodarza. Dodatkowo olejek goździkowy wywołuje stres oksydacyjny w komórkach Candida spp., co prowadzi do perforacji błon komórkowych, uszkodzenia materiału genetycznego i śmierci komórki. Mechanizm ten wygląda podobnie w przypadku S. aureus. Olejek goździkowy dzięki lipofilowej strukturze wchodzi w rekcję z błoną komórkową, powodując wzrost zawartości kwasów tłuszczowych o niskiej masie cząsteczkowej, oraz prowadzi do powstania wolnych rodników wewnątrz komórki, co skutkuje uszkodzeniem DNA. Olejek goździkowy również blokuje niektóre enzymy bakteryjne, takie jak: proteazy, amylazy i ATP-azy (10).

Zestawiając ze sobą trzy płukanki złożone (tylko jedna z nich zawiera w swoim składzie olejek goździkowy – płyn Aseptall, gotowy do użycia), można zauważyć, że dodatek silnie działającego olejku goździkowego nie wykazał synergizmu w stosunku do działania grzybobójczego CHG. Jest to prawdopodobnie związane ze zmniejszonym stężeniem tej substancji w preparacie (wielkość zastrzeżona tajemnicą handlową firmy). Między płukankami bez dodatku olejku goździkowego a płukanką z jego dodatkiem brak znamiennej statystycznie różnicy w zahamowaniu wzrostu drożdży. Podobnie wygląda analiza wyników związana z bakteriami. Działanie bakteriobójcze złożonego preparatu zawierającego olejek goździkowy nie jest statystycznie znamiennie różne w stosunku do innych badanych płukanek bez tej substancji. Jednak wszystkie komercyjne preparaty złożone posiadały silniejsze (znamiennie statystycznie) działanie bakteriobójcze w stosunku do szczepów S. pyogenes i S. aureus niż czysty nierozcieńczony olejek goździkowy. E. faecalis oraz S. aeoruginosa nie wykazały różnicy statystycznej w swojej wrażliwości na czysty olejek goździkowy i inne płukanki złożone.

Aloes (Aloe barbadensis leaf juice) stanowi wyciąg ze świeżych liści Aloe arborescens, rozcieńczony z wodą w stosunku 1:4. Jego czysty preparat nie powodował powstania strefy zahamowania wzrostu przy jakimkolwiek badanym mikroorganizmie. Natomiast dodatek wyciągu z aloesu dzięki swoim właściwościom przeciwzapalnym i immunomodulacyjnym zwiększa odpowiedź immunologiczną gospodarza, ułatwiając gojenie się ran. Zestawiając ze sobą płukankę Aseptall Concentrate – bez aloesu – oraz Aseptall Spray i Aseptall Płyn – z wyciągiem z aloesu – w przypadku Candida spp. wyniki nie różnią się znamiennie statystycznie. Brak też istotnych różnic pomiędzy wrażliwością poszczególnych szczepów drożdży. Porównując skuteczność tych samych płukanek w stosunku do ocenianych bakterii można również zauważyć brak różnic znamiennych statystycznie, zarówno pomiędzy preparatami, jak i poszczególnymi szczepami (11).

D-pantenol i witamina E to dwie ostatnie substancje pomocnicze użyte jako dodatek w badanych preparatach złożonych.

D-pantenol (prowitamina B5) jest to analog kwasu pantotenowgo – składowej koenzymu A. Wykazuje działanie przeciwzapalne, łagodzi podrażnienia błony śluzowej i wpływa na szybkość jej regeneracji. Dodatkowo pełni funkcję substancji nawilżającej. Stymuluje proliferację fibroblastów, które biorą istotny udział w gojeniu się ran (12), dlatego często znajduje zastosowanie w leczeniu i łagodzeniu problemów związanych z błoną śluzową i skórą. Jest on dodatkiem każdej z płukanek użytych w badaniu, dlatego trudno ocenić jego wpływ na skuteczność CHG w tym modelu doświadczenia.

Witamina E jest silnym antyoksydantem oraz bierze udział w prawidłowym formowaniu błon fosfolipidowych komórek organizmu. Pełni znaczącą rolę w procesach gojenia się i regeneracji błon śluzowych po miejscowych uszkodzeniach, co wynika z działania antyoksydacyjnego i przeciwzapalnego. Jest ona dodatkiem do Aseptall Spray i Aseptall Płyn. Porównując ich skuteczność dezynfekującą w stosunku do Aseptall Concentrate (bez jej dodatku), zarówno wśród drożdży, jak i bakterii, stwierdzono brak istotności statystycznej.

Wnioski

Wszystkie oceniane złożone płukanki wykazały się bardzo dobrym działaniem zarówno grzybobójczym, jak i bakteriobójczym w stosunku do ocenianych mikroorganizmów.

Zastosowanie dodatkowych substancji czynnych, niezależnie od ich konfiguracji, nie powodowało zmiany skuteczności ocenianych płukanek złożonych.

Maciej Jabłoński, Julia Bartecka, Julia Maślanka – Student, koło naukowe Katedry i Zakładu Chorób Przyzębia i Błony Śluzowej Jamy Ustnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
dr n. biol. Małgorzata Kępa – Katedra Mikrobiologii Wydziału Nauk Farmaceutycznych w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Maciej Tarnawski – Student, koło naukowe Zakładu Ortodoncji, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
dr hab. n. med. Rafał Wiench – Katedra i Zakład Chorób Przyzębia i Błony Śluzowej Jamy Ustnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

Piśmiennictwo

1. Schmalz G., Bindslev D.A.: Biocompatibility of Dental Materials. Springer Science & Business Media, 2008, 351.
2. Malicka B., Ziętek M., Grzebieluch W.: Zastosowanie chlorheksydyny w stomatologii. „Dent Med Probl”, 2005, 42, 497-505.
3. Łukomska-Szymańska M., Sokołowski J., Łapińska B.: Chlorheksydyna – mechanizm działania i zastosowanie w stomatologii. „Czasopismo Stomatologiczne”, 2017, 70, 4, 405-417.
4. Balagopal S., Arjunkumar R.: Chlorhexidine: The gold standard antiplaque agent. „J Pharm Sci Res.”, 2013, 5, 12, 270-274.
5. Abeck D., Mempel M., Seidl H.P. i wsp.: Impetigo contagiosa. Erregerspektrum und therapeutische Konsequenzen (Contagious impetigo pathogen spectrum and therapeutic consequences). „Dtsch Med Wochenschr.”, 2000, 125, 42, 1257-1259.
6. Vinayagamoorthy K., Pentapati K.C., Prakash H.: Prevalence, risk factors, treatment and outcome of multidrug resistance Candida auris infections in Coronavirus disease (COVID-19) patients: A systematic review. „Myc Oses.”, 2022, 65, 6, 613-624.
7. EUCAST eucast: EUCAST Breakpoints v 9.0 (2019) available.
8. Chaffin W.L.: Candida albicans cell wall proteins. „Microbiol Mol Biol Rev.”, 2008, 72, 3, 495-544.
9. Salih O., He S., Planamente S. i wsp.: Atomic Structure of Type VI Contractile Sheath from Pseudomonas aeruginosa. „Structure.”, 2018, 26, 2, 329-336.e3.
10. Marchese A., Barbieri R., Coppo E. i wsp.: Antimicrobial activity of eugenol and essential oils containing eugenol: A mechanistic viewpoint. „Critical Reviews in Microbiology”, 2017, 43, 6, 668.
11. Sahebjamee M., Mansourian A., Mohammad M.H. i wsp.: Comparative efficacy of Aloe vera and benzydamine mouthwashes on radiation-induced oral mucositis: A triple-blind, randomised, controlled clinical trial. „Oral Health Prev. Dent”, 2015, 13, 309-315.
12. Ebner F., Heller A., Rippke F. i wsp.: Topical Use of Dexpanthenol in Skin Disorders. „Am J Clin Dermatol”, 2002, 3, 427-433.